Laukas biotechnologijos yra vienas iš nuolatinių pokyčių. Spartus pažangiausių tyrimų augimas ir plėtra priklauso nuo mokslininkai ir jų gebėjimas įžvelgti potencialą pagrindinėje molekulinėje technikoje ir pritaikyti jį naujoje procesai. Polimerazės grandininės reakcijos atsiradimas (PGR) atvėrė daug durų genetiniams tyrimams, įskaitant priemones DNR analizė ir skirtingų genų identifikavimas pagal jų DNR sekas. DNR seka taip pat priklauso nuo mūsų sugebėjimo naudoti gelio elektroforezė atskirti DNR grandines, kurių dydis skiriasi tik viena bazine pora.
DNR sekos nustatymas
Aštuntojo dešimtmečio pabaigoje buvo išrastos dvi ilgesnių DNR molekulių DNR sekos sudarymo metodikos: Sangerio (arba didezoksi) metodas ir Maxam-Gilbert (cheminio skaidymo) metodas. Maksamo-Gilberto metodas pagrįstas specifiniu nukleotidų skaidymu cheminėmis medžiagomis ir geriausiai naudojamas sekti oligonukleotidus (trumpus nukleotidų polimerus, paprastai mažesnius nei 50 bazių porų). Sanger metodas yra labiau paplitęs, nes buvo įrodyta, kad jis yra techniškai lengviau pritaikomas kartu su PGR atsiradimas ir technologijos automatizavimas lengvai pritaikomas ilgoms DNR sruogoms, įskaitant visas genai. Ši technika pagrįsta grandinės nutraukimu dideoksinukleotidais PGR pailgėjimo reakcijų metu.
Sangerio metodas
Taikant Sangerio metodą, analizuojama DNR grandinė naudojama kaip šablonas, o DNR polimerazė naudojama PGR reakcijoje, norint sugeneruoti papildomas grandines, naudojant pradmenis. Paruošiami keturi skirtingi PGR reakcijos mišiniai, kurių kiekviename yra tam tikras procentas dideoksinukleozidų trifosfato (ddNTP) analogų, esančių viename iš keturių nukleotidų (ATP, CTP, GTP arba TTP).
Naujos DNR grandinės sintezė tęsiama tol, kol neįtraukiamas vienas iš šių analogų, tuo metu styga per anksti sutrumpėja. Kiekvienoje PGR reakcijoje bus skirtingo ilgio DNR sruogų mišinys, kuris baigsis nukleotidu, kuris buvo žymimas to meto reakcija. Gelis elektroforezė tada naudojamas keturių reakcijų sruogoms atskirti keturiose atskirose juostose ir pradinio šablono seka nustatoma pagal tai, koks sruogų ilgis baigiasi su kokiu nukleotidu.
Automatizuotoje „Sanger“ reakcijoje naudojami pradmenys, paženklinti keturiais skirtingų spalvų fluorescenciniais ženklais. PGR reakcijos, esant skirtingiems dideoksinukleotidams, atliekamos taip, kaip aprašyta aukščiau. Tačiau po to keturi reakcijos mišiniai sujungiami ir uždedami ant vienos gelio juostos. Kiekvieno fragmento spalva nustatoma lazerio spinduliu, o informacija renkama kompiuteriu kuri generuoja chromatogramas su kiekvienos spalvos smailėmis, iš kurių gali būti šablono DNR seka Atkaklus.
Paprastai automatinis sekos nustatymo metodas tikslus tik sekoms, kurių ilgis yra ne daugiau kaip apie 700–800 bazinių porų. Tačiau įmanoma gauti visas didesnių genų sekas ir, tiesą sakant, ištisus genomus, naudojant laipsniškus metodus, tokius kaip vaikščiojimas gruntu ir šautuvo seką.
Pradėjus vaikščioti, darbingesnė didesnio geno dalis seka Sangero metodu. Nauji pradmenys yra generuojami iš patikimo sekos segmento ir naudojami tęsti geno dalį, kuri buvo už pradinių reakcijų ribų.
Šaudymo pistoleto seka reiškia, kad atsitiktinai padalijamas dominantis DNR segmentas į tinkamesnį (valdomo) dydžio fragmentus, kiekvieną fragmentą padalijant į eilę ir išdėstant gabalus remiantis sutapimais sekos. Šią techniką palengvino kompiuterių programinė įranga, skirta išdėstyti sutampančius gabalus.