TBE buferis (Tris-boratas-EDTA) yra buferinis tirpalas, sudarytas iš Tris bazės, boro rūgšties ir EDTA (etilendiamintetraacto rūgšties). Šis buferis dažnai naudojamas agarozės gelio elektroforezei analizuoti DNR produktus, gautus atlikus PGR amplifikaciją, DNR gryninimo protokolus ar DNR klonavimo eksperimentus.
TBE naudojimas
TBE buferis yra ypač naudingas mažesnių DNR fragmentų (MW <1000) atskyrimui, pavyzdžiui, mažų DNR fragmentų restrikcijos fermentas virškina. TBE turi didesnę buferinę galią ir suteiks ryškesnę skiriamąją gebą nei TAE buferis. TAE (Tris-acetato-EDTA) buferis yra tirpalas, sudarytas iš Tris bazės, acto rūgšties ir EDTA.
TBE paprastai yra brangesnis nei TAE ir slopina DNR ligazę, o tai gali sukelti problemų, jei numatomi tolesni DNR gryninimo ir ligavimo etapai. Atlikdami tris paprastus veiksmus, sužinokite, kaip sudaryti TBE buferį. Sukurti neturėtų užtrukti daugiau nei 30 minučių.
Ko tau reikia
Norėdami padaryti TBE buferį, jums reikės tik keturių medžiagų. Likusios šio sąrašo prekės yra įranga. Keturios reikalingos medžiagos yra EDTA dinatrio druska, Tris bazė, boro rūgštis ir dejonizuotas vanduo.
Kalbant apie įrangą, jums prireiks pH matuoklio ir kalibravimo standartų. Be to, jums prireiks maždaug 600 mililitrų ir 1500 mililitrų stiklinių ar kolbų. Jūsų poreikiams patenkinti yra graduoti cilindrai, maišymo juostos ir maišymo plokštės.
Patikrinkite inventorių laboratorijoje, kurią naudosite, kad įsitikintumėte, jog turite viską, ko jums reikia prieš pradėdami. Nieko nėra blogiau, nei sustojus ruošti tirpalą, nes pritrūko tinkamų medžiagų.
Jei laboratorija yra mokykloje ar jūsų darbo vietoje, pasitarkite su tinkamu personalu ir įsitikinkite, kad jie turi visas atsargas. Galų gale galite tai sutaupyti laiko ir energijos.
Formulės svoris yra sutrumpintas kaip FW. Tai yra elemento atominė masė, padauginta iš kiekvieno elemento atomų skaičiaus formulėje, tada sudėjus visas kiekvieno elemento mases.
Pagrindinis sprendimas EDTA
EDTA sprendimas turėtų būti parengtas iš anksto. EDTA nebus visiškai patenka į tirpalą, kol pH nebus sureguliuotas iki maždaug 8,0. 500 mililitrų pradinio 0,5 M EDTA tirpalo pasverkite 93,05 g EDTA dinatrio druskos (FW = 372,2). Tada ištirpinkite jį 400 mililitrų dejonizuoto vandens ir sureguliuokite pH NaOH (natrio hidroksidu). Po to tirpalas papildomas iki galutinio 500 mililitrų tūrio.
Pradinis sprendimas TBE
Padarykite koncentruotą (5x) pradinį TBE tirpalą, pasverdami 54 gramus Tris bazės (FW = 121,14) ir 27,5 gramų boro rūgšties (FW = 61.83) ir abu ištirpinami maždaug 900 mililitrų dejonizuoto vandens. Tada įpilkite 20 mililitrų 0,5 M (molinės masės arba koncentracijos) EDTA (pH 8,0) ir sureguliuokite tirpalą iki galutinio 1 litro tūrio. Šį tirpalą galima laikyti kambario temperatūroje, tačiau senesniuose tirpaluose susidarys nuosėdos. Laikykite buferį stikliniuose buteliuose ir išmeskite, jei susidarė nuosėdų.
Darbinis TBE sprendimas
Agarozės gelio elektroforezei naudoti galima naudoti TBE buferį, kurio koncentracija yra 0,5x (koncentruoto pradinio tirpalo praskiedimas santykiu 1:10). Pradinį tirpalą praskieskite 10 kartų dejonizuotame vandenyje. Galutinės tirpių koncentracijos yra 45 mM Tris-borato ir 1 mM (milimolių) EDTA. Buferis dabar paruoštas naudojimui teka agarozės geliu.