polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra molekulinė genetinė technika, skirta kelioms geno kopijoms gaminti, taip pat yra genų sekos nustatymo proceso dalis.
Kaip veikia polimerazės grandininė reakcija
Genų kopijos daromos naudojant DNR pavyzdį, o technologija yra pakankamai gera, kad būtų galima padaryti kelias kopijas iš vienos mėginyje rastos geno kopijos. Geno PGR amplifikacija, siekiant padaryti milijonus kopijų, leidžia aptikti ir identifikuoti genų sekas, naudojant vizualinius metodus, pagrįstus DNR dalies dydžiu ir krūviu (+ arba -).
Kontroliuojamomis sąlygomis mažus DNR segmentus generuoja fermentai, žinomi kaip DNR polimerazės, kurie prideda papildomų deoksinukleotidų. (dNTP) į DNR dalį, žinomą kaip „šablonas“. Net mažesnės DNR dalys, vadinamos „pradukais“, yra naudojamos kaip atspirties taškas polimerazė.
Pradmenys yra mažos žmogaus sukurtos DNR dalys (oligomerai), paprastai nuo 15 iki 30 nukleotidų ilgio. Jie susidaro žinant arba atspėjant trumpas DNR sekas pačiuose amplifikuojamo geno galuose. PGR metu sekvenuojama DNR kaitinama ir atsiskiria dvigubos grandinės. Atvėsus, gruntai prisijungia prie šablono (vadinamas atkaitinimu) ir sukuria vietą polimerazei pradėti.
PGR technika
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) tapo įmanoma atradus termofilus ir termofilus polimerazės fermentai (fermentai, kurie palaiko struktūrinį vientisumą ir funkcionalumą po kaitinimo aukštoje temperatūroje temperatūros). PGR technikos veiksmai yra tokie:
- Sukuriamas mišinys su optimizuotomis DNR šablono, polimerazės fermento, pradmenų ir dNTP koncentracijomis. Galimybė šildyti mišinys nedenatūruojant fermento leidžia denatūruoti dvigubą DNR mėginio spiralę 94 laipsnių temperatūroje Celsijaus.
- Po denatūravimo mėginys atšaldomas iki vidutinio diapazono, maždaug 54 laipsnių, o tai palengvina pradmenų susiliejimą (surišimą) su vienagrandžiais DNR šablonais.
- Trečiajame ciklo etape mėginys pakartotinai pašildomas iki 72 laipsnių, idealios temperatūros Taq DNR polimerazei, pailgėjimui. Prailginimo metu DNR polimerazė naudoja originalią vieną DNR grandinę kaip šabloną, kad pridėtų papildomus dNTP. iki kiekvieno pradmens 3’ galų ir generuoja dvigrandės DNR sekciją dominančio geno srityje.
- Pradmenys, susijungę su DNR sekomis, kurios nėra tikslios atitikties, nelieka atkaitintos 72 laipsnių kampu, todėl ribojamas dominančio geno pailgėjimas.
Šis denatūravimo, atkaitinimo ir pailginimo procesas kartojamas daug (30–40) kartų, taip eksponentiškai padidinant norimo geno kopijų skaičių mišinyje. Nors šis procesas būtų gana varginantis, jei būtų atliekamas rankiniu būdu, mėginius galima paruošti ir inkubuoti a programuojamas Thermocycler, dabar įprastas daugelyje molekulinių laboratorijų, ir visa PGR reakcija gali būti atlikta 3-4 valandas.
Kiekvienas denatūravimo etapas sustabdo ankstesnio ciklo pailgėjimo procesą, taip sutrumpina naują DNR grandinę ir išlaiko ją maždaug iki norimo geno dydžio. Pailgėjimo ciklo trukmė gali būti ilgesnė arba sutrumpinta, atsižvelgiant į dominančio geno dydį, bet ilgainiui naudojant pakartotinius PGR, dauguma šablonų bus apriboti tik dominančio geno dydžiu, nes jie bus sukurti iš abiejų gruntai.
Yra keletas skirtingų sėkmingo PGR faktoriai kuriais galima manipuliuoti siekiant pagerinti rezultatus. Plačiausiai naudojamas PGR produkto buvimo tyrimo metodas agarozės gelio elektroforezė. Kuris naudojamas atskirti DNR fragmentus pagal dydį ir krūvį. Tada fragmentai vizualizuojami naudojant dažus arba radioizotopus.
Evoliucija
Nuo PGR atradimo buvo aptiktos kitos nei originalios Taq DNR polimerazės. Kai kurie iš jų turi geresnes „korektūros“ galimybes arba yra stabilesni aukštesnėje temperatūroje, todėl pagerėja PGR specifiškumas ir sumažėja klaidų, atsirandančių dėl neteisingo dNTP įterpimo.
Kai kurie PGR variantai buvo sukurti specifiniams tikslams ir dabar yra reguliariai naudojami molekulinės genetinės laboratorijose. Kai kurie iš jų yra realaus laiko PGR ir atvirkštinės transkriptazės PGR. PGR atradimas taip pat paskatino DNR sekos nustatymą, DNR pirštų atspaudų ėmimas ir kiti molekuliniai metodai.