Baltymų gryninimo metodai biotechnologijose

Svarbus biotechnologinių tyrimų komponentas yra baltymų inžinerijos metodų panaudojimas baltymams projektuoti ar modifikuoti. Šie baltymų gryninimo būdai optimizuoja baltymų savybes konkrečiam pramoniniam naudojimui.

Dėl šių metodų mokslininkai turi išskirti ir išgryninti dominančius baltymus, kad būtų galima ištirti jų konfigūraciją ir substrato specifiškumą. Tyrimą taip pat reikia atlikti su kitomis ligandų (baltymo, kuris prisijungia prie baltymo receptoriaus) reakcijomis ir specifine fermento veikla.

Reikalingas baltymų grynumo laipsnis priklauso nuo numatomo galutinio baltymo vartojimo. Kai kuriems tikslams pakanka nevalyto ekstrakto. Reikalingas aukštas grynumo lygis kitais atvejais, pavyzdžiui, maisto produktuose ir vaistuose. Keletas metodų baltymų gryninimas naudojami pasiekti reikiamą grynumo lygį.

Kiekvienas baltymų gryninimo etapas paprastai sukelia tam tikrą produkto praradimą. Todėl ideali baltymų gryninimo strategija yra ta, kurioje aukščiausias gryninimo laipsnis pasiekiamas per mažiausius žingsnius.

Kurių žingsnių pasirinkimas priklauso nuo tikslinio baltymo dydžio, krūvio, tirpumo ir kitų savybių. Šie metodai yra tinkamiausi vienam citozoliniam baltymui išvalyti.

Citozolinių baltymų kompleksų valymas yra sudėtingesnis ir paprastai reikalauja, kad būtų taikomi skirtingi metodai.

Pirmasis tarpląstelinių (ląstelės viduje) baltymų gryninimo žingsnis yra neapdoroto ekstrakto paruošimas. Ekstrakte bus sudėtingas visų baltymų, gautų iš ląstelės citoplazmos, mišinys, taip pat kai kurios papildomos makromolekulės, kofaktoriai ir maistinės medžiagos.

Šis neapdorotas ekstraktas gali būti naudojamas kai kuriems biotechnologijų tikslams. Tačiau jei problema yra grynumas, reikia atlikti kitus valymo veiksmus. Žaliavalgių ekstraktai paruošiami pašalinant ląstelių likučius, susidarančius ląstelių lizės metu, kuris gaunamas naudojant chemines medžiagas, fermentai, ultragarsu ar „French Press“.

Nuosėdos pašalinamos centrifuguojant, o supernatantas (skystis virš kietos liekanos) regeneruojamas. Neapdorotus tarpląstelinių (išorinių ląstelių) baltymų preparatus galima gauti paprasčiausiai pašalinant ląsteles centrifuguojant.

Dėl tam tikrų biotechnologijos Taikant programas, yra poreikis termiškai stabilių fermentų - fermentų, kurie gali toleruoti aukštą temperatūrą nedenaturuodami, išlaikydami aukštą specifinį aktyvumą.

Organizmai, gaminantys karščiui atsparius baltymus, kartais vadinami ekstremofilais. Lengvas būdas išvalyti karščiui atsparius baltymus yra denatūruoti kitus baltymus mišinyje tirpalas kaitinamas, tada atšaldomas (tokiu būdu leidžiama termostabiliam fermentui reformuotis arba ištirpti, jei būtina). Denatūruoti baltymai gali būti pašalinti centrifuguojant.

Šiuolaikiška biotechnologija protokolais dažnai pasinaudojama daugeliu komerciškai prieinamų rinkinių ar metodų, kurie pateikia paruoštus sprendimus standartinėms procedūroms. Baltymų valymas dažnai atliekamas naudojant filtrus ir paruoštas gelio filtravimo kolonėles.

Vykdykite dializės rinkinio instrukcijas, pridėkite reikiamą kiekį tinkamo tirpalo ir palaukite nurodytą laiką renkant eluentą (tirpiklį praleido per kolonėlę) naujame bandyme vamzdis.

Chromatografijos metodai gali būti taikomi naudojant kolonų kolonėles arba automatinę HPLC įrangą. Atskyrimas HPLC gali būti atliekamas atvirkštinės fazės, jonų mainų ar dydžio išskyrimo metodais, o mėginiai aptinkami diodų matricomis arba lazerio technologijomis.

Anksčiau įprastas antrasis baltymo iš neapdoroto ekstrakto išgryninimo žingsnis buvo nusodinimas didelio osmoso stiprumo tirpale (t. Y. Druskos tirpalai). Baltymai paprastai nusodinami naudojant druską kaip amonio sulfatą. Neapdoroto ekstrakto nukleorūgštys gali būti pašalintos nusodinant agregatus, suformuotus streptomicino sulfatu arba protamino sulfatu.

Druskos kritimas paprastai nedaro labai išgrynintų baltymų, tačiau gali padėti pašalinti kai kuriuos nepageidaujamus baltymus mišinyje ir sukoncentruoti mėginį. Po to tirpale esančios druskos pašalinamos dialize, naudojant porėtus celiuliozės vamzdelius, filtruojant arba atliekant gelio išskyrimo chromatografiją.

Skirtingi baltymai nusodinami esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms. Paprastai didesnės molekulinės masės baltymai nusėda mažesnėmis amonio sulfato koncentracijomis.

Atvirkštinės fazės chromatografija (RPC) atskiria baltymus pagal jų santykinį hidrofobiškumą (nepolinių molekulių pašalinimas iš vandens). Ši technika yra labai selektyvi, tačiau jai reikia naudoti organinius tirpiklius.

Kai kuriuos baltymus visam laikui denatūruoja tirpikliai ir RPC metu jie praranda funkcionalumą. Todėl šis metodas nerekomenduojamas visais atvejais, ypač jei reikia, kad tikslinis baltymas išlaikytų aktyvumą.

Jonų mainų chromatografija reiškia baltymų atskyrimą remiantis krūviu. Kolonėlės gali būti paruoštos anijonų arba katijonų mainams. Anijonų mainų kolonose yra nejudanti fazė, turinti teigiamą krūvį, kuris pritraukia neigiamai įkrautus baltymus.

Katijonų mainų kolonėlės yra atvirkštinės, neigiamai įkrautos granulės, kurios pritraukia teigiamai įkrautus baltymus. Tikslinis (-iai) baltymas (-iai) išplaunamas (ekstrahuojant vieną medžiagą iš kitos) keičiant pH stulpelį, dėl kurio kiekvienos įkrautos funkcinės grupės pasikeičia arba neutralizuojamos baltymas.

Dydžio išskyrimo chromatografija (dar vadinama gelio filtravimu) atskiria didesnius baltymus nuo mažesnių nes didesnės molekulės chromatografijoje greičiau pereina per susietą polimerą stulpelis. Dideli baltymai netelpa į polimero poras, tuo tarpu mažesni baltymai turi mažiau laiko, kol per chromatografijos koloną keliauja ne tokiu tiesioginiu keliu.

Eluatas (eliuavimo rezultatas) surenkamas į mėgintuvėlius, atskiriančius baltymus pagal eliuavimo laiką. Gelio filtravimas yra naudinga priemonė baltymo mėginiui sukoncentruoti, nes tikslinis baltymas surenkamas mažesniu eliuavimo tūriu, nei iš pradžių buvo įpilta į kolonėlę. Panašūs filtravimo būdai gali būti naudojami gaminant didelius baltymus dėl jų ekonominio efektyvumo.

Afiniteto chromatografija yra labai naudinga technika „poliruoti“ arba užbaigti baltymų gryninimo procesą. Chromatografijos stulpelyje esantys rutuliukai yra kryžmiškai susieti su ligadais, kurie specifiškai jungiasi su tiksliniu baltymu.

Tada baltymas pašalinamas iš kolonėlės, praplaunant tirpalu, kuriame yra laisvųjų ligandų. Šis metodas suteikia gryniausius rezultatus ir didžiausią specifinį aktyvumą, palyginti su kitais metodais.

SDS-PAGE (natrio dodecilsulfatas, naudojamas su poliakrilamido gelio elektroforeze) jungiasi su baltymais, suteikdamas jiems didelį neigiamą neigiamą krūvį. Kadangi visų baltymų krūviai yra gana vienodi, šis metodas juos beveik visiškai atskiria pagal dydį.

SDS-PAGE dažnai naudojamas baltymų grynumui tikrinti po kiekvienos sekos. Kadangi nepageidaujami baltymai iš mišinio palaipsniui pašalinami, SDS-PAGE gelyje matomų juostų skaičius sumažėja, kol yra tik viena juosta, atspindinti norimą baltymą.

Imunoblotingas yra baltymų vizualizacijos metodas, taikomas kartu su afiniteto chromatografija. Specifinio baltymo antikūnai yra naudojami kaip ligandai afinitetinės chromatografijos kolonėlėje.

Tikslinis baltymas išlaikomas ant kolonėlės, tada pašalinamas, skalaujant kolonėlę druskos tirpalu ar kitais agentais. Antikūnai, susieti su radioaktyviosiomis medžiagomis arba dažų etiketėmis, padeda aptikti tikslinį baltymą, kai jis yra atskirtas nuo likusio mišinio.