PGR reiškia polimerazės grandininė reakcija, molekulinės biologijos technika, skirta amplifikuoti DNR segmentus, generuojant kelias kopijas, naudojant kontroliuojamomis sąlygomis DNR polimerazės fermentus. Vien DNR segmento ar geno kopiją galima klonuoti į milijonus egzempliorių, kad būtų galima aptikti naudojant dažus ir kitus vizualizacijos būdus.
Sukurtas 1983 m., PGR procesas leido atlikti DNR sekos nustatymas ir nustatyti nukleotidų eiliškumą atskiruose genuose. Metodas naudojamas šiluminiu ciklu arba pakartotiniu reakcijos kaitinimu ir aušinimu DNR lydymui ir replikacijai. Toliau vykstant PGR, „naujoji“ DNR naudojama kaip šablonas replikacijai ir vyksta grandininė reakcija, eksponentiškai sustiprindama DNR šabloną.
PGR metodai taikomi daugelyje biotechnologijų sričių, įskaitant baltymų inžinerija, klonavimas, teismo ekspertizė (DNR pirštų atspaudai), tėvystės tyrimai, paveldimų ir (arba) infekcinių ligų diagnozavimas ir analizė aplinkos mėginių.
Kriminalistikoje PGR ypač naudinga, nes ji sustiprina net mažiausią DNR įrodymų kiekį. PGR taip pat gali būti naudojamas analizuoti tūkstančių metų senumo DNR, ir šie metodai buvo naudojami viskam identifikuoti - nuo 800 000 metų mamuto iki mumijų iš viso pasaulio.
PGR procedūra
Pradėjimas
Šis žingsnis yra būtinas tik DNR polimerazėms, kurioms reikia PGR karšto paleidimo. Reakcija pašildoma iki 94–96 ° C ir palaikoma 1-9 minutes.
Denatūracija
Jei procedūros nereikia inicijuoti, pirmas žingsnis yra denatūravimas. Reakcija kaitinama iki 94-98 ° C 20-30 sekundžių. DNR šablono vandenilio ryšiai yra nutraukiami ir sukuriamos viengrandinės DNR molekulės.
Atkaitinimas
Reakcijos temperatūra yra žemesnė nuo 50 iki 65 ° C ir palaikoma 20–40 sekundžių. Gruntai atkaitina viengrandį DNR šabloną. Atliekant šį žingsnį temperatūra yra labai svarbi. Jei per karšta, gruntas gali neprisijungti. Jei per šalta, gruntas gali nepriekaištingai sulipti. Geras ryšys susidaro, kai pradmenų seka artimai atitinka šablono seką.
Pratęsimas / pailginimas
Temperatūra šiame etape kinta priklausomai nuo polimerazės rūšies. DNR polimerazė sintezuoja visiškai naują DNR grandinę.
Galutinis pailgėjimas
Šis žingsnis atliekamas 70-74 ° C temperatūroje 5-15 minučių po paskutinio PGR ciklo.
Galutinis sulaikymas
Šis žingsnis yra neprivalomas. Temperatūra palaikoma 4-15 ° C ir sukelia reakciją.
Trys PGR procedūros etapai
Eksponentinis stiprinimas
Kiekvieno ciklo metu produktas (konkretus DNR gabalas, kuris yra replikuojamas) yra dvigubai didesnis.
Išlyginamasis etapas
Kadangi DNR polimerazė praranda aktyvumą ir sunaudoja reagentus, reakcija sulėtėja.
Plokščiakalnis
Daugiau produkto nesikaupia.