Viskas apie apribojimų fermentus

Restrikcijos endonukleazės yra klasė fermentas kad pjauna DNR molekules. Kiekvienas fermentas atpažįsta unikalias DNR grandinės nukleotidų sekas - paprastai maždaug keturių – šešių bazių porų. Sekos yra palindrominės tuo, kad komplementuojančios DNR grandinės turi tą pačią seką atvirkštine kryptimi. Kitaip tariant, abi DNR grandinės yra supjaustytos toje pačioje vietoje.

Restrikcijos fermentai randami daugelyje skirtingų bakterijų padermių, kur jų biologinis vaidmuo dalyvauja ląstelių gynyboje. Šie fermentai riboja pašalines (virusines) DNR, patenkančias į ląsteles, jas sunaikindami. Ląstelės-šeimininkės turi restrikcijos modifikavimo sistemą, kuri metiliuoja jų pačių DNR vietose, būdingose ​​jų atitinkamiems restrikcijos fermentams, taip apsaugodama jas nuo skilimo. Daugiau nei 800 žinomi fermentai buvo atrasta daugiau kaip 100 skirtingų nukleotidų sekų.

Yra penki skirtingi restrikcijos fermentų tipai. I tipas DNR pjausto atsitiktinėse vietose iki 1000 ar daugiau bazinių porų nuo atpažinimo vietos. III tipo pjūviai yra maždaug 25 bazių porų atstumu nuo aikštelės. Abiem šiems tipams reikalingas ATP ir jie gali būti dideli fermentai su keliais subvienetais. II tipo fermentai, kurie daugiausia naudojami biotechnologijose, DNR supjaustomi atpažįstama seka be ATP poreikio ir yra mažesni ir paprastesni.

II tipo restrikcijos fermentai yra įvardijami pagal bakterijų rūšis, iš kurių jie yra išskirti. Pavyzdžiui, iš E buvo išskirtas fermentas EcoRI. coli. Didžioji dalis visuomenės yra susipažinę su E. coli protrūkiai maiste.

II tipo restrikcijos fermentai gali generuoti dviejų skirtingų tipų pjūvius, priklausomai nuo to, ar jie pjauna abu kryptys atpažinimo sekos centre arba kiekviena styga arčiau vieno atpažinimo galo seka.

Dėl buvusio pjūvio susidarys „neryškūs galai“ be nukleotidų iškyšų. Pastarasis sukuria „lipnius“ arba „rišlius“ galus, nes kiekvienas gautas DNR fragmentas turi iškyšas, papildančias kitus fragmentus. Abu jie yra naudingi molekulinėje genetikoje gaminant rekombinantinė DNR ir baltymai. Ši DNR forma išsiskiria tuo, kad gaunama sujungiant dvi ar daugiau skirtingų gijų, kurios iš pradžių nebuvo sujungtos.

IV tipo fermentai atpažįsta metiliuotą DNR, o V tipo fermentai naudoja RNR, kad supjaustytų sekcijas ant okupuojančių organizmų, kurie nėra palindrominiai.

Restrikcijos fermentai yra naudojami biotechnologijose DNR suskaidyti į mažesnes sruogas, siekiant ištirti fragmentų ilgio skirtumus tarp asmenų. Tai vadinama restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmu (RFLP). Jie taip pat naudojami genų klonavimui.

RFLP metodai buvo naudojami siekiant nustatyti, ar individai ar individų grupės pasižymi ryškiais genų sekų skirtumais ir restrikcijos skilimo modeliais tam tikrose genomo vietose. Šių unikalių sričių žinojimas yra pagrindas DNR pirštų atspaudai. Kiekvienas iš šių metodų priklauso nuo naudojimo agarozės gelio elektroforezė DNR fragmentų atskyrimui. Agarozės geliui dažniausiai naudojamas TBE buferis, kurį sudaro Tris bazė, boro rūgštis ir EDTA elektroforezė ištirti DNR produktus.

Klonuojant dažnai reikia įterpti geną į plazmidę, kuri yra DNR gabalo rūšis. Restrikcijos fermentai gali padėti procese dėl viengyslių perdengimų, kuriuos jie palieka atlikdami pjūvius. DNR ligazė, atskiras fermentas, gali sujungti dvi DNR molekules su atitinkamais galais.

Taigi, naudojant restrikcijos fermentus su DNR ligazės fermentais, DNR gabaliukai iš skirtingų šaltinių gali būti naudojami sukurti vieną DNR molekulę.