Gramo dažymo procedūra mikrobiologijoje

„Gram“ dažymas yra diferencinis dažymo būdas, naudojamas priskyrimui bakterijos į vieną iš dviejų grupių (gramteigiamą ir gramneigiamą), remiantis jų ląstelių sienos. Jis taip pat žinomas kaip dažymas gramais arba Gramo metodas. Procedūra pavadinta metodą sukūrusiam asmeniui, danų bakteriologui Hansui Christianui Gramui.

Procedūra pagrįsta peptidoglikano reakcija kai kurių bakterijų ląstelių sienelėse. „Gram“ dažymas apima bakterijų dažymą, spalvos fiksavimą šarvu, spalvų pašalinimą ląstelėse ir paviršiaus padengimą.

1. Pirminė dėmė (krištolo violetinė) jungiasi su peptidoglikanu, dažydamas ląsteles purpurine spalva. Tiek gramteigiamų, tiek gramneigiamų ląstelių ląstelių sienelėse yra peptidoglikano, taigi iš pradžių visos bakterijos nusidažo violetine spalva.
2. Gramo jodo (jodo ir kalio jodidas) naudojamas kaip šarmas arba fiksatorius. Gram-teigiamos ląstelės sudaro krištolo violetinės-jodo kompleksą.
3. Alkoholis arba acetonas naudojamas ląstelėms pašalinti. Gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelėse yra daug mažiau peptidoglikano, todėl šis veiksmas iš esmės daro jas bespalves, tuo tarpu iš gramteigiamų ląstelių, turinčių daugiau peptidoglikano (60–90% ląstelės sienos), pašalinama tik dalis spalvos. Storoji gramteigiamų ląstelių sienelė yra dehidratuojama spalvinimo etapu, todėl jos susitraukia ir įstrigę dėmės-jodo komplekse.
   instagram viewer
4. Po spalvos pašalinimo bakterijos nusidažo rausva spalva, naudojant dažiklį (dažniausiai safraniną, bet kartais ir fuksiną). Tiek gramteigiamos, tiek gramneigiamos bakterijos surenka rausvą dėmę, tačiau virš tamsiai violetinės spalvos gramneigiamų bakterijų jos nesimato. Jei dažymo procedūra bus atlikta teisingai, gramteigiamos bakterijos bus purpurinės, o gramneigiamos bakterijos - rausvos.

Peržiūrimi „Gram“ dėmės rezultatai naudojant šviesos mikroskopiją. Kadangi bakterijos yra spalvotos, nustatoma ne tik jų „Gram“ dėmių grupė, bet jų formaGali būti stebimas jų dydis, dydžiai ir gumulėliai. Dėl to „Gram“ dėmė yra vertinga medicinos klinikos ar laboratorijos diagnostikos priemonė. Nors dėmė gali neabejotinai identifikuoti bakterijas, norint išrašyti veiksmingą antibiotiką dažnai pakanka žinoti, ar jos yra gramteigiamos, ar gramneigiamos.

Kai kurios bakterijos gali būti kintamos arba neapibrėžtos gramais. Tačiau net ši informacija gali būti naudinga susiaurinant bakterijų tapatumą. Metodas patikimiausias, kai kultūros yra senesnės nei 24 valandos. Nors jis gali būti naudojamas sultinių kultūroms, geriau juos pirmiausia išcentrifuguoti. Pagrindinis technikos apribojimas yra tas, kad ji padaro klaidingus rezultatus, jei technikoje daroma klaidų. Norint gauti patikimą rezultatą, reikia praktikos ir įgūdžių. Infekcijos sukėlėjas gali būti ne bakterinis. Eukariotiniai patogenai dažo gramneigiamai. Tačiau dauguma eukariotų ląstelės išskyrus tai, kad grybeliai (įskaitant mieles) proceso metu neprilimpa prie stiklelio.

• Kristalų violetinė spalva (pirminė dėmė)
• Gramo jodas (šarmas, skirtas pritvirtinti krištolo violetinę ląstelės sienelę)
• Etanolis arba acetonas (nudažiklis)
• Safraninas (antrinė dėmė arba antžeminė danga)
• Vanduo purškiamame buteliuke arba lašintuve
• Mikroskopo skaidrės
• Sudėtinis mikroskopas

1. Ant stiklelio uždėkite nedidelį lašą bakterijų mėginio. Šiluma pritvirtinkite bakterijas prie stiklelio, tris kartus perleisdamos pro Bunseno degiklio liepsną. Taikant per daug šilumos arba per ilgai, bakterijos ląstelių sienos gali ištirpti, iškraipyti jų formą ir sukelti netikslų rezultatą. Jei įkaista per mažai šilumos, bakterijos dažymo metu nuplauna stiklinę.
2. Naudokite lašintuvą, kad pagrindinę dėmę (krištolo violetinę) užteptų ant stiklelio ir leiskite jai sėdėti 1 minutę. Švelniai nuplaukite stiklinę vandeniu ne ilgiau kaip 5 sekundes, kad pašalintumėte dėmės perteklių. Per ilgai plaunant gali būti pašalinta per daug spalvų, tuo tarpu per ilgai neskalbus gali likti per daug dėmių ant gramneigiamų ląstelių.
3. Naudokite lašintuvą, kad ant stiklelio užteptumėte „Gram“ jodo, kad pritvirtintumėte krištolo violetinę prie ląstelės sienos. Leiskite jam sėdėti 1 minutę.
4. Maždaug 3 sekundes skaidrę nuplaukite alkoholiu arba acetonu, po to atsargiai nuplaukite vandeniu. Gramneigiamos ląstelės praranda spalvą, o gramteigiamos ląstelės liks violetinės arba mėlynos. Tačiau jei dažiklis bus paliktas per ilgai, visos ląstelės praras spalvą!
5. Užtepkite antrinę dėmę, safraniną ir leiskite sėdėti 1 minutę. Švelniai nuplaukite vandeniu ne ilgiau kaip 5 sekundes. Gramneigiamos ląstelės turėtų būti dažytos raudonai arba rausvai, o gramteigiamos ląstelės vis tiek pasirodys purpurinės arba mėlynos spalvos.
6. Peržiūrėkite skaidrę skaidriu mikroskopu. Norint atskirti ląstelės formą ir išdėstymą, gali reikėti padidinimo nuo 500x1000x.

Ne visos bakterijos, identifikuotos pagal „Gram“ dėmę, yra susijusios su ligomis, tačiau keli svarbūs pavyzdžiai yra šie:

• Gramteigiami kokciai (apvalūs):Staphylococcus aureus
• Gramneigiami kokciai:Neisseria meningitidis
• Gramteigiamos bacilos (lazdelės): Bacillus anthracis
• Gramneigiamos bacilos:Escherichia coli